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原位杂交天

1. 重新水化和固定

1）吸取固定好的胚胎，加入50%的PBST溶液，放置5分钟。

2）置换成30%的PBST溶液，放置5分钟

3）置换成PBST溶液，放置5分钟，重复一次

4）置换成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟5）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

蛋白酶处理与后固定（本实验不做此步）

1）用10ul/ml的蛋白酶K在室温下处理胚胎。5体节以下的胚胎不处理，5体节到24小时的胚胎处理3分钟，24小时以上的胚胎处理5分钟或者更长。发育时间越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶处理，发育时间长的胚胎就需要用蛋白酶来疏松组织，以便于杂交。

2）用PBST溶液轻洗，在PBST中放置5分钟。

3）用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分钟，室温。

4）用PBST洗两次，每次放置五分钟，室温。

2. 预杂交

1）每个管中置换成大约300ulHYB－溶液，60℃水浴5分钟，避免振荡。

2）用等体积的HYB+取代HYB－。

3）60℃水浴，预杂交4小时以上。

3. 杂交

1）吸去预杂交的HYB+，加上100ul已加入探针的HYB+溶液（探针浓度约为1ng/ul）..

2）60℃ 温浴过夜。注：杂交与预杂交的温度可以是55到60度不等，温度越低，探针结合越好，温度越高，背景越小。

1、组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞在30 min 内固定。

2、细胞组织固定目的与注意事项：

（1）保持细胞结构；

（2）大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；

（3）使探针易于进入细胞或组织。

常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。

后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。

原位杂交的预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。

杂交——按每张切片20μι杂交液，加在切片上。将原位杂交专1用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。

杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。